單細胞轉(zhuǎn)錄組測序
近年來，隨著科學(xué)技術(shù)水平的更新?lián)Q代，越來越多的單細胞技術(shù)得到了發(fā)展。如人類細胞圖譜、小鼠細胞圖譜、小鼠RNA圖譜、小鼠ATAC圖譜和植物細胞圖譜等大型項目，已經(jīng)產(chǎn)生了大量單細胞組學(xué)數(shù)據(jù)。通過空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和單細胞多組學(xué)，甚至可以解讀空間動態(tài)多級調(diào)控機制。這些單細胞技術(shù)在腫瘤學(xué)、輔助生殖、胚胎發(fā)育和植物育種等領(lǐng)域有許多成功的應(yīng)用。單細胞測序通常包括單細胞基因組測序，單細胞表觀測序，以及單細胞轉(zhuǎn)錄組測序。我們這里以單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）為例來給大家進行介紹。
單細胞測序的應(yīng)用
在已經(jīng)擁有RNA-Seq測序技術(shù)的前提下，我們?yōu)槭裁催€要進行單細胞測序？單細胞測序技術(shù)之所以重要并被廣泛研究和應(yīng)用，主要是因為它具有以下幾個關(guān)鍵的優(yōu)勢和目的：
? 揭示細胞異質(zhì)性：在傳統(tǒng)的群體細胞測序中，只能獲得細胞群體的平均基因表達水平，這會掩蓋細胞間的個體差異。單細胞測序可以揭示細胞群體內(nèi)部的異質(zhì)性，識別不同的細胞亞群和狀態(tài)。
? 深入理解疾病機制：單細胞測序有助于深入理解復(fù)雜疾病的發(fā)病機制，如腫瘤的微環(huán)境、不同細胞類型的相互作用以及疾病進展過程中的細胞動態(tài)變化。
? 精確診斷和治療：通過對單個細胞的基因表達和遺傳變異進行分析，可以為疾病提供更精確的診斷，并有助于開發(fā)個性化的治療方案。
? 細胞發(fā)育和分化研究：單細胞測序技術(shù)可以追蹤細胞分化過程中的基因表達變化，揭示干細胞分化為特定細胞類型的分子機制。
? 免疫學(xué)研究：單細胞測序有助于研究免疫細胞的多樣性和功能，理解免疫應(yīng)答的復(fù)雜性，為疫苗開發(fā)和免疫治療提供信息。
? 神經(jīng)科學(xué)：在神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域，單細胞測序可以揭示不同類型神經(jīng)元的基因表達特征，增進對大腦功能和神經(jīng)退行性疾病的理解。
? 微生物群落研究：單細胞測序技術(shù)可以分析微生物群落中的物種多樣性和功能，有助于環(huán)境科學(xué)和生態(tài)學(xué)研究。
? 提高研究分辨率：單細胞測序提供了一種高分辨率的方法來研究生物學(xué)問題，可以觀察到傳統(tǒng)方法無法檢測到的細微變化。
? 發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)記物：通過分析單個細胞的基因表達，可以發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的新的生物標(biāo)記物，為早期診斷和治療提供可能。
? 推動精準醫(yī)療：單細胞測序技術(shù)的發(fā)展推動了精準醫(yī)療的進步，使得醫(yī)療干預(yù)可以更精確地針對個體的細胞特征。
總之，單細胞測序技術(shù)因其能夠提供細胞層面的詳細和全面信息，已成為現(xiàn)代生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中不可或缺的工具。研究單細胞測序的方法有很多，每種單細胞測序技術(shù)的實驗流程都有其特定的步驟和特點。我們通過以下是幾種常見單細胞測序技術(shù)來為大家進行相應(yīng)的介紹：
? Smart-seq2
★ 原理：對單個細胞的mRNA進行全轉(zhuǎn)錄組的擴增和測序。
★ 優(yōu)點：提供全長轉(zhuǎn)錄組信息，適合于低通量、高精度的研究。
★ 缺點：通量較低，成本較高，不適合大規(guī)模樣本分析。
★ 應(yīng)用場景：適用于需要全長mRNA信息的研究，如可變剪接事件分析、小樣本量的細胞狀態(tài)研究。
SMART-Seq2實驗原理
? 10X Genomics Chromium
★ 原理：基于微流控技術(shù)和油包水乳液的微滴技術(shù)，每個微滴包含一個細胞和反應(yīng)所需的組分，進行cDNA合成和擴增。
★ 優(yōu)點：高通量，可同時處理大量細胞；使用UMI技術(shù)，減少PCR擴增偏倚。
★ 缺點：成本較高；數(shù)據(jù)量較大，需要較強的計算資源。
★ 應(yīng)用場景：適用于需要大規(guī)模單細胞分析的研究，如腫瘤異質(zhì)性、免疫細胞狀態(tài)分析等。
★ 實驗流程：
1. 細胞分離與裝載：將單個細胞分離并通過微流控技術(shù)裝載到芯片上。
2. 乳液滴生成：形成油包水乳液滴，每個乳液滴包含一個細胞和反應(yīng)組分。
3. 細胞裂解與cDNA合成：在乳液滴內(nèi)進行細胞裂解和cDNA合成。
4. 文庫構(gòu)建：cDNA進行擴增和標(biāo)記，構(gòu)建測序文庫。
5. 測序：使用Chromium平臺和Illumina測序技術(shù)進行測序。
6. 數(shù)據(jù)分析：包括數(shù)據(jù)解包、比對、定量、聚類分析等。
10× Genomics實驗原理
? Drop-seq
★ 原理：使用微流控技術(shù)，將單個細胞與微珠結(jié)合，微珠帶有獨特的barcode，用于區(qū)分不同細胞的mRNA。
★ 優(yōu)點：高通量，成本效益高；適用于稀有細胞類型的分析。
★ 缺點：可能存在較高的dropout率（在單細胞測序（single-cell sequencing）中，"Dropout"率是指在測序過程中，由于各種原因?qū)е履承┗蚧蜣D(zhuǎn)錄本沒有被檢測到的現(xiàn)象。），即某些基因在測序中未被檢測到。
★ 應(yīng)用場景：適合于大規(guī)模的細胞狀態(tài)和類型的分類研究。
★ 實驗流程：
1. 細胞懸液制備：制備細胞懸液并通過微流控技術(shù)進行操作。
2. 微珠裝載：細胞與帶有獨特barcode的微珠結(jié)合。
3. 乳液滴生成：形成包含細胞和微珠的乳液滴。
4. 細胞裂解與cDNA合成：在乳液滴內(nèi)進行細胞裂解和cDNA合成。
5. 文庫構(gòu)建與擴增：構(gòu)建測序文庫并進行PCR擴增。
6. 高通量測序：進行高通量測序。
7. 數(shù)據(jù)分析：包括barcode解復(fù)用、比對、定量、聚類分析等。
Drop-seq實驗原理
? Micro-well
★ 原理：通過微孔板技術(shù)，每個微孔捕獲一個細胞，進行細胞裂解和cDNA合成。
★ 優(yōu)點：操作簡便，成本相對較低。
★ 缺點：通量受限于微孔板的孔數(shù)，不適合超大規(guī)模樣本。
★ 應(yīng)用場景：適合于中小規(guī)模的單細胞測序，如特定細胞類型的功能研究。
★ 實驗流程：
1.細胞懸液制備：制備細胞懸液。
2.細胞分配：將細胞分配到微孔板的每個孔中，理想情況下每個孔一個細胞。
3.細胞裂解與cDNA合成：在孔中進行細胞裂解和cDNA合成。
4.文庫構(gòu)建：構(gòu)建測序文庫。
5.高通量測序：進行高通量測序。
6.數(shù)據(jù)分析：包括數(shù)據(jù)質(zhì)控、比對、定量、差異表達分析等。
Micro-well實驗原理
? SPLiT-seq
★ 原理：結(jié)合了微流控技術(shù)和微孔技術(shù)，通過物理分割單個細胞，進行測序。
★ 優(yōu)點：適用于有限的細胞數(shù)量，可以結(jié)合細胞表面標(biāo)記進行分析。
★ 缺點：技術(shù)操作復(fù)雜，需要特定的設(shè)備和條件。
★ 應(yīng)用場景：適用于有限數(shù)量的細胞樣本，需要結(jié)合細胞表面標(biāo)記的研究。
★ 實驗流程：
1.細胞懸液制備：制備細胞懸液。
2.細胞分配：將細胞分配到微孔板的每個孔中。
3.物理分割：物理分割每個孔以確保每個孔中只有一個細胞。
4.細胞裂解與cDNA合成：在孔中進行細胞裂解和cDNA合成。
5.文庫構(gòu)建：構(gòu)建測序文庫。
6.高通量測序：進行高通量測序。
7.數(shù)據(jù)分析：進行數(shù)據(jù)質(zhì)控、比對、定量和聚類分析。
SPLiT-seq實驗原理
? MARS-seq
★ 原理：基于微流控技術(shù)，通過微滴包裹單個細胞，進行mRNA捕獲和測序。
★ 優(yōu)點：能夠提供單細胞水平的基因表達數(shù)據(jù)。
★ 缺點：可能存在較高的drop out率和基因檢測的不穩(wěn)定性。
★ 應(yīng)用場景：適用于需要中等通量單細胞測序的研究。
★ 實驗流程：
1.細胞懸液制備：制備細胞懸液。
2.微流控技術(shù)：使用微流控技術(shù)將單個細胞封裝在微滴中。
3.細胞裂解與cDNA合成：在微滴中進行細胞裂解和cDNA合成。
4.文庫構(gòu)建：構(gòu)建測序文庫。
5.高通量測序：進行高通量測序。
6.數(shù)據(jù)分析：進行數(shù)據(jù)質(zhì)控、比對、定量和聚類分析。
MARS-seq實驗原理
每種技術(shù)的實驗流程都旨在從單個細胞中獲取遺傳信息，并將其放大到足以進行高通量測序的水平。數(shù)據(jù)分析是單細胞測序的關(guān)鍵部分，需要專業(yè)的生物信息學(xué)工具和方法來處理和解釋大量的數(shù)據(jù)。
Smart-seq2技術(shù)作為常用的單細胞RNA測序技術(shù)之一，它具有一些獨特的優(yōu)勢，這些優(yōu)勢在某些研究場景中具有不可替代性：
1.全長轉(zhuǎn)錄組測序：
Smart-seq2可以提供單個細胞的全長cDNA序列，這意味著可以獲得完整的mRNA信息，包括所有外顯子和剪接變體。這對于鑒定和分析可變剪接事件至關(guān)重要。其他技術(shù)可能只能提供部分轉(zhuǎn)錄本信息，無法全面了解剪接模式。
2.低dropout率：
相比于一些基于標(biāo)簽的方法（如Drop-seq或10X Genomics），Smart-seq2通常具有更低的dropout率，這意味著較少的基因表達信息在測序中被遺漏。在研究稀有細胞類型時，確保所有基因表達事件都能被捕獲是非常重要的。Smart-seq2較低的dropout率意味著即使是低豐度的轉(zhuǎn)錄本也更有可能被檢測到。
3.適用于稀有或珍貴樣本：
由于Smart-seq2可以提供高質(zhì)量的全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，它特別適合用于那些難以獲得大量細胞或樣本非常珍貴的研究。
4.高靈敏度和準確性：
Smart-seq2技術(shù)能夠檢測到低豐度的轉(zhuǎn)錄本，并且由于其較低的dropout率，它在定量基因表達方面具有較高的準確性。
5.可變剪接分析：
由能夠獲得完整的轉(zhuǎn)錄本序列，Smart-seq2特別適合于研究可變剪接事件，這對于理解基因調(diào)控和功能至關(guān)重要。
6.適用于小規(guī)模樣本：
Smart-seq2技術(shù)適合于研究少量細胞，例如在研究特定類型的細胞或組織時，這可能是一個重要的優(yōu)勢。例如，可研究的神經(jīng)元樣本數(shù)量有限時，那么選擇一種能夠提供最全面信息的技術(shù)變得尤為重要。Smart-seq2適合這種情況，因為它可以從少量細胞中捕獲完整的轉(zhuǎn)錄組信息。
7.技術(shù)成熟：
Smart-seq2是一種較早開發(fā)的單細胞測序技術(shù)，因此擁有更多的文獻支持和成熟的實驗流程。
全長轉(zhuǎn)錄組擴增試劑盒TransNGS? Whole Transcriptome Amplification Kit (KC921) 以 WTA Oligo (dT) 為逆轉(zhuǎn)錄引物，并應(yīng)用合成效率高、且具有模板置換活性的逆轉(zhuǎn)錄酶在 cDNA 的 3’ 端添加一段特殊序列，從而得到全長 cDNA 產(chǎn)物。可兼容多種細胞和組織類型，適用于 RNA 含量各異的細胞材料。一個單細胞文庫通?？梢垣@得 10-60 ng 的全長轉(zhuǎn)錄組擴增產(chǎn)物。
產(chǎn)品特點
? 細胞類型兼容性強，可適用于 RNA 含量較低的細胞（如免疫細胞）
? 組織類型兼容性強，可適用于較難解離的組織（如腦組織）
? 單個細胞文庫建庫產(chǎn)量高，峰型優(yōu)異，且有效檢出基因（FPKM>1）的數(shù)目高
? 樣本兼容體積高達 6 μl，可適配不同濃度 RNA 或不同數(shù)量細胞的擴增
適用范圍
? 1-105 個哺乳動物細胞或無細胞壁結(jié)構(gòu)的真核細胞（如原生質(zhì)體）
? 10 pg-100 ng 總 RNA（包含有poly (A) 序列的 mRNA）
實驗數(shù)據(jù)
cDNA 產(chǎn)物長度提升，完整度更好
對不同細胞數(shù)的 HeLa 細胞、不同起始量煙草 RNA 和不同類型細胞（1000 cells）進行全長 cDNA 擴增后建庫，文庫峰型結(jié)果顯示， TransGen 產(chǎn)品 cDNA 產(chǎn)物長度更長。
不同起始量細胞建庫
不同起始量RNA建庫
不同類型細胞建庫
rRNA占比低
使用 TransGen 產(chǎn)品對不同細胞數(shù)的 HeLa 細胞、不同起始量煙草 RNA 和不同類型細胞（1000 cells）進行全長 cDNA 擴增后進行 Tn5 建庫測序，測序結(jié)果顯示， rRNA 占比低，數(shù)據(jù)質(zhì)量高。
有效基因檢測數(shù)高
使用 TransGen 產(chǎn)品對不同細胞數(shù)的 HeLa 細胞、不同起始量煙草 RNA 和不同類型細胞（1000 cells）進行全長 cDNA 擴增后進行 Tn5 建庫測序，測序結(jié)果顯示，測序數(shù)據(jù)質(zhì)量高，有效基因檢出數(shù)高。
產(chǎn)品信息
產(chǎn)品名稱 | 目錄號 | 規(guī)格 |
TransNGS? Single Cell Full Length cDNA Synthesis&Amplification Kit | KC901 | 12/24/96 rxns |
TransNGS? Whole Transcriptome Amplification Kit | KC921 | 12/96 rxns |
